Mechanizmy opornosci dla inhibitora kinazy tyrozynowej Brutona Ibutynib AD 3

Warianty wcześniej zgłoszone w bazie danych DBSNP, build 137, zostały odfiltrowane, a pozostałe warianty zostały opatrzone przypisami, a ich potencjalne efekty mutacyjne przewidywano za pomocą SnpEff, wersja 3.4.20. Wreszcie, nowo nabyte, specyficzne dla nawrotu, niesynonimowe mutacje zostały zweryfikowana za pomocą sekwencjonowania Sanger lub Ion Torrent.
DNA ekstrahowano z kriokonserwowanych komórek za pomocą zestawu QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). BTK i PLC2 analizowano za pomocą platformy Ion Torrent z Life Technologies.
Konstrukty DNA i kultura komórkowa
System Transposon Vector firmy PiggyBac (System Biosciences) został użyty do wygenerowania konstruktów DNA BTK zarówno z markerami selekcji zielonej fluorescencji i markerem puromycyny, a ekspresja białka była kontrolowana przy użyciu promotora -aktyny z kurczaka.
Test kinazy in vitro
Pełnej długości znakowane His6 i Strep BTK i BTK C481S ulegały ekspresji w kom rkach ssaczych HEK-EBNA i oczyszczano za pomocą chromatografii powinowactwa. Oczyszczone białka (100 ng na mililitr) zastosowano w teście kinazy LANCE Ultra (PerkinElmer), z 100 nM ULight-poly GT (PerkinElmer) jako substratem i 200 ?M ATP. Związki preinkubowano w temperaturze pokojowej z enzymem przed reakcją kinazy. Po 45 minutach reakcji kinazowej dodano nadmiar EDTA i znakowane europem przeciwciało anty-poli-GT inkubowano przed pomiarem sygnału w czytniku płytek EnVision z podwójnym laserem (PerkinElmer), ustawionym na długość fali wzbudzenia 320 nm i długość fali emisji od 615 do 665 nm.
Testy cytometrii przepływowej i immunoblot
Komórki HEK 293T przejściowo transfekowano wskazanymi konstruktami ekspresyjnymi, traktowano ibrutinibem przez godzinę, i utrwalono paraformaldehydem lub przemyto świeżą pożywką, a następnie utrwalono. Komórki permeabilizowano, barwiono i analizowano na analizatorze BD FACSCanto II (BD Biosciences).
Do tes tów immunoblotowych przygotowano lizaty całokomórkowe i równoważne ilości białka rozdzielono na żelu poliakryloamidowym i przeniesiono na membrany nitrocelulozowe. Po inkubacji przeciwciał wykryto białka przy użyciu substratu chemiluminescencyjnego (SuperSignal, Pierce). Szczegółowe informacje na temat zastosowanych przeciwciał znajdują się w dodatkowym dodatku.
Analiza statystyczna
Metody statystyczne dla poszczególnych eksperymentów zostały szczegółowo opisane w dodatkowym dodatku.
Wyniki
Mutacje w BTK i PLC?2 ujawnione przez sekwencjonowanie całego egzaminu
Tabela 1 [podobne: pasta budwigowa biała, rezonans magnetyczny cena badania, pasta budwigowa ]

Powiązane tematy z artykułem: ginekolog na nfz lublin pasta budwigowa rezonans magnetyczny cena badania